Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13915-3:2023 (hoàn toàn tương đương với ISO 23893-3:2013) về Chất lượng nước - Các phép đo sinh lý và sinh hóa trên cá - Phần 3: Xác định Vitellogenin được công bố nhằm hướng dẫn phương pháp định lượng vitellogenin trong các mẫu sinh học của cá. Đây là một công cụ quan trọng trong việc đánh giá tác động của các chất ô nhiễm hữu cơ và các chất gây rối loạn nội tiết (endocrine disruptors) đối với hệ sinh thái nước.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này quy định các quy trình và nguyên tắc kỹ thuật để xác định nồng độ vitellogenin trong huyết tương, huyết thanh hoặc dịch đồng thể từ gan của cá. Đối tượng áp dụng bao gồm các phòng thử nghiệm phân tích môi trường, các cơ quan quản lý chất lượng nước, các nhà nghiên cứu độc học sinh thái và các tổ chức giám sát đa dạng sinh học thủy sinh.

Nguyên tắc chung của phép đo Vitellogenin

• Vitellogenin (VTG) là một phospholipoglycoprotein tiền thân của lòng đỏ trứng, bình thường được tổng hợp ở gan của cá cái dưới sự kích thích của estrogen.
• Sự xuất hiện của VTG trong máu hoặc gan của cá đực hoặc cá chưa trưởng thành là một chỉ thị sinh học (biomarker) đặc hiệu cho thấy cá đã tiếp xúc với các chất có hoạt tính estrogen ngoại sinh trong môi trường nước.
• Phép đo này giúp phát hiện sớm tình trạng ô nhiễm nguồn nước bởi các hợp chất bắt chước hormone, ngay cả ở nồng độ cực thấp trước khi các biểu hiện lâm sàng hoặc suy giảm quần thể xuất hiện.

Quy trình thu thập và chuẩn bị mẫu thử

• Thu hoạch mẫu: Mẫu máu hoặc mẫu gan phải được thu thập từ cá sống hoặc cá vừa mới chết một cách nhanh chóng để tránh sự phân hủy protein.
• Sử dụng chất ức chế: Phải bổ sung các chất ức chế protease (như aprotinin) vào mẫu ngay sau khi thu thập để ngăn ngừa sự phân hủy của vitellogenin bởi các enzyme nội sinh.
• Bảo quan mẫu: Mẫu sau khi xử lý sơ bộ cần được đông băng ngay lập tức ở nhiệt độ tối thiểu -70 độ C hoặc trong nitơ lỏng để đảm bảo tính ổn định của protein trước khi tiến hành phân tích.

Phương pháp phân tích và định lượng

• Kỹ thuật ELISA: Phương pháp phổ biến và được khuyến nghị nhất là xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), sử dụng các kháng thể đặc hiệu (kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng) chống lại vitellogenin của loài cá mục tiêu.
• Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng vitellogenin tinh sạch của chính loài cá đó để thiết lập đường cong chuẩn, giúp quy đổi giá trị mật độ quang học (OD) đo được thành nồng độ vitellogenin thực tế.
• Đánh giá kết quả: Nồng độ vitellogenin được biểu thị bằng đơn vị nanogam trên mililit (ng/mL) đối với mẫu huyết tương hoặc microgam trên gam (µg/g) đối với mẫu gan.

Yêu cầu về kiểm soát chất lượng (QA/QC)

• Độ nhạy và giới hạn phát hiện: Phòng thử nghiệm phải xác định rõ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của quy trình phân tích đối với từng loài cá cụ thể.
• Độ đặc hiệu của kháng thể: Kháng thể sử dụng trong phép đo phải được chứng minh là có phản ứng chéo đặc hiệu với vitellogenin của loài cá thử nghiệm và không phản ứng chéo với các protein khác.
• Độ lặp lại: Các phép đo song song phải được thực hiện để kiểm soát sai số ngẫu nhiên trong quá trình thao tác.

Hiệu lực thi hành

TCVN 13915-3:2023 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được Bộ Khoa học và Công nghệ công bố ban hành, hướng dẫn chi tiết quy trình kỹ thuật chuẩn hóa cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.