Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8975:2018 (hoàn toàn tương đương với EN 14152:2014) về Thực phẩm - Xác định vitamin B2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 (riboflavin) trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm thống nhất quy trình kiểm nghiệm và đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm.

Phạm vi áp dụng và đối tượng áp dụng

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 trong các loại thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp này đã được nghiên cứu, thử nghiệm và xác nhận giá trị sử dụng đối với nhiều nền mẫu thực phẩm khác nhau.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm tra chất lượng thực phẩm, các tổ chức và cá nhân hoạt động trong lĩnh vực sản xuất, chế biến, xuất nhập khẩu thực phẩm có nhu cầu xác định hàm lượng vitamin B2.

Nguyên tắc của phương pháp xác định

• Riboflavin trong mẫu thực phẩm được giải phóng bằng cách thủy phân bằng axit, sau đó được xử lý bằng enzym (như takadiastase hoặc các enzym tương đương) để chuyển hóa các este photphat của riboflavin thành riboflavin tự do.
• Dịch chiết sau khi xử lý được làm sạch và phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo, sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện và định lượng riboflavin dựa trên cường độ phát xạ huỳnh quang.

Yêu cầu về thiết bị, dụng cụ và hóa chất

• Thiết bị HPLC: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được trang bị detector huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 468 nm và bước sóng phát xạ khoảng 520 nm) hoặc detector UV-Vis (bước sóng khoảng 444 nm).
• Cột sắc ký: Sử dụng cột pha đảo (C18 hoặc tương đương) có khả năng tách tốt riboflavin ra khỏi các tạp chất khác trong nền mẫu thực phẩm.
• Hóa chất và thuốc thử: Riboflavin chuẩn có độ tinh khiết cao (tối thiểu 98%), các dung môi dùng cho HPLC như metanol, axetonitril, nước siêu sạch, các axit (axit clohydric, axit axetic) và các chế phẩm enzym hoạt tính cao để thủy phân liên kết photphat.

Quy trình thực hiện chi tiết

• Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thực phẩm phải được nghiền nhỏ, trộn đều và đồng nhất hóa hoàn toàn trước khi cân để đảm bảo tính đại diện cho toàn bộ lô mẫu.
• Quá trình thủy phân: Cân một lượng mẫu xác định vào bình định mức, thêm dung dịch axit clohydric và tiến hành đun cách thủy hoặc hấp áp suất trong một khoảng thời gian quy định. Sau khi để nguội, điều chỉnh pH của hỗn hợp về khoảng tối ưu cho hoạt động của enzym, thêm enzym và tiến hành ủ ở nhiệt độ thích hợp để giải phóng hoàn toàn riboflavin tự do.
• Chuẩn bị dung dịch đo: Sau khi kết thúc quá trình thủy phân bằng enzym, dung dịch được định mức đến thể tích quy định, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 micromet trước khi bơm vào hệ thống HPLC.
• Tiến hành phân tích trên HPLC: Thiết lập các điều kiện vận hành tối ưu cho hệ thống sắc ký (tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột). Bơm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử để ghi nhận sắc ký đồ và xác định thời gian lưu của riboflavin.

Tính toán và biểu thị kết quả

• Hàm lượng vitamin B2 (riboflavin) trong mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic hoặc chiều cao pic thu được từ sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử so với đường chuẩn được xây dựng từ các dung dịch chuẩn riboflavin có nồng độ đã biết.
• Kết quả phân tích được biểu thị bằng miligam trên 100 gam (mg/100g) hoặc miligam trên kilôgam (mg/kg) sản phẩm, có tính đến các hệ số pha loãng và độ ẩm của mẫu (nếu có yêu cầu).

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8975:2018 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Tiêu chuẩn này cung cấp một phương pháp chuẩn hóa, có độ tin cậy và độ lặp lại cao, giúp thống nhất hoạt động kiểm nghiệm vitamin B2 tại Việt Nam phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế hiện hành.