Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14389:2025 về Phân bón - Định lượng Bacillus laterosporus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) quy định phương pháp thống nhất nhằm xác định mật độ vi sinh vật này trong các sản phẩm phân bón vi sinh vật tại Việt Nam. Tiêu chuẩn này là công cụ kỹ thuật quan trọng giúp các phòng thử nghiệm, cơ quan quản lý và doanh nghiệp kiểm soát chính xác chất lượng phân bón chứa chủng vi khuẩn có ích này.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định quy trình định lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong các loại phân bón vi sinh vật, phân bón hữu cơ vi sinh và các loại phân bón khác có bổ sung chủng vi sinh vật này.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các tổ chức chứng nhận, phòng thử nghiệm chất lượng phân bón, các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh phân bón và các cơ quan quản lý nhà nước có liên quan đến hoạt động kiểm tra chất lượng phân bón lưu thông trên thị trường.

Nguyên lý của phương pháp thử nghiệm

• Kỹ thuật đếm khuẩn lạc: Mẫu phân bón được đồng nhất và pha loãng theo dãy thập phân. Dịch pha loãng sau đó được cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp và ủ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu để kích thích sự phát triển của các khuẩn lạc Bacillus laterosporus. Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch.
• Khẳng định bằng phản ứng PCR: Chọn lọc các khuẩn lạc nghi ngờ có đặc điểm hình thái đặc trưng của Bacillus laterosporus để tiến hành tách chiết DNA. Sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen mục tiêu, từ đó khẳng định chính xác sự hiện diện của loài Bacillus laterosporus, loại trừ các sai lệch do nhiễm tạp hoặc nhầm lẫn với các loài Bacillus khác.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, môi trường nuôi cấy

• Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm: Thiết bị cơ bản phục vụ phân tích vi sinh bao gồm tủ cấy vô trùng (tủ an toàn sinh học), tủ ấm duy trì nhiệt độ ổn định, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy ly tâm, cân phân tích có độ chính xác cao, máy lắc trộn (vortex).
• Thiết bị phục vụ phản ứng PCR: Máy nhân gen (PCR thermal cycler), hệ thống điện di gel agarose, máy chụp ảnh gel hoặc đèn đọc gel chuyên dụng.
• Hóa chất và môi trường: Môi trường thạch dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của Bacillus, nước muối sinh lý hoặc dung dịch đệm pha loãng mẫu, bộ hóa chất tách chiết DNA (DNA extraction kit), các thành phần phản ứng PCR (bao gồm Taq polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, nước không chứa nuclease) và các cặp mồi đặc hiệu cho Bacillus laterosporus.

Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành cân một lượng mẫu phân bón xác định trong điều kiện vô trùng, hòa tan và đồng nhất mẫu trong dung dịch pha loãng. Thực hiện pha loãng mẫu theo các nồng độ thập phân liên tiếp (10^-1, 10^-2, 10^-3,...) tùy thuộc vào mật độ vi sinh vật dự kiến trong mẫu.
• Nuôi cấy và đếm khuẩn lạc: Hút một thể tích dịch pha loãng chính xác cấy trải hoặc cấy đổ đĩa trên môi trường thạch dinh dưỡng. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ từ 30 độ C đến 37 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ. Chọn các đĩa thạch có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tối ưu (thường từ 30 đến 300 khuẩn lạc) để đếm và ghi nhận số lượng khuẩn lạc nghi ngờ.
• Tách chiết DNA khuôn: Thu nhận sinh khối từ các khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa thạch. Tiến hành ly giải tế bào và tách chiết DNA bằng phương pháp nhiệt hoặc sử dụng bộ kit tách chiết thương mại để thu được DNA chất lượng cao làm khuôn cho phản ứng PCR.
• Thực hiện phản ứng PCR: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR (Master Mix) chứa cặp mồi đặc hiệu cho Bacillus laterosporus. Cho DNA khuôn vào hỗn hợp và tiến hành chạy chương trình nhiệt trên máy PCR (bao gồm các giai đoạn: biến tính ban đầu, chu kỳ nhiệt gồm biến tính - bắt cặp - kéo dài, và giai đoạn kéo dài cuối cùng).
• Điện di và đọc kết quả PCR: Tiến hành điện di sản phẩm PCR trên gel agarose có chứa chất nhuộm DNA. Quan sát vạch điện di dưới ánh sáng tia cực tím hoặc hệ thống chụp ảnh gel. Mẫu được khẳng định là Bacillus laterosporus khi xuất hiện vạch sản phẩm PCR có kích thước hoàn toàn trùng khớp với kích thước của đối chứng dương và đúng theo thiết kế của cặp mồi đặc hiệu.

Tính toán và biểu thị kết quả

• Công thức tính toán: Mật độ vi khuẩn Bacillus laterosporus trong mẫu phân bón được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch được chọn, hệ số pha loãng tương ứng và tỷ lệ số khuẩn lạc được khẳng định là Bacillus laterosporus qua phản ứng PCR trên tổng số khuẩn lạc nghi ngờ được thử nghiệm.
• Biểu thị kết quả: Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên một đơn vị khối lượng hoặc thể tích mẫu (CFU/g đối với phân bón dạng rắn hoặc CFU/mL đối với phân bón dạng lỏng), được làm tròn theo các quy tắc toán học quy định trong tiêu chuẩn.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14389:2025 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành theo quyết định của cơ quan nhà nước có thẩm quyền. Tiêu chuẩn này thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp thử nghiệm trước đây nhằm nâng cao độ chính xác, độ tin cậy và tính thống nhất trong hoạt động kiểm tra chất lượng phân bón vi sinh vật tại Việt Nam.