Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14114:2024 về Phân bón - Định lượng Bacillus thuringiensis bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc quy định phương pháp xác định mật độ vi sinh vật đối với các loại phân bón có chứa chủng vi khuẩn này. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng phân bón vi sinh vật, phân bón hữu cơ vi sinh và các chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp tại Việt Nam.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong các sản phẩm phân bón bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy thạch rắn.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, cơ quan quản lý nhà nước về chất lượng phân bón, các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu và kinh doanh phân bón vi sinh vật tại Việt Nam.

Nguyên tắc của phương pháp định lượng

Phương pháp dựa trên việc giải phóng các tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ mẫu phân bón vào dung dịch pha loãng thích hợp. Tiến hành chuẩn bị một dãy các dung dịch pha loãng thập phân từ dung dịch mẫu ban đầu. Sau đó, cấy một lượng thể tích xác định của các dung dịch pha loãng lên hoặc vào môi trường nuôi cấy thạch dinh dưỡng thích hợp. Sau khi ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên đĩa thạch và tính toán mật độ vi khuẩn có trong một đơn vị khối lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu phân bón ban đầu.

Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị và dụng cụ: Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh tiêu chuẩn bao gồm tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định, nồi hấp tiệt trùng để khử trùng dụng cụ và môi trường, máy lắc mẫu, cân phân tích có độ chính xác cao, pipet tự động, đĩa Petri và các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng khác.
• Môi trường nuôi cấy và thuốc thử: Sử dụng các môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của Bacillus thuringiensis (như thạch dinh dưỡng Nutrient Agar hoặc các môi trường chuyên dụng tương đương) và dung dịch pha loãng (như nước muối peptone hoặc dung dịch đệm phosphat) đã được tiệt trùng hoàn toàn.

Quy trình thực hiện thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành đồng nhất mẫu phân bón trước khi cân. Đối với phân bón dạng rắn, cân một lượng mẫu xác định và hòa tan vào dung dịch pha loãng để tạo dung dịch huyền phù ban đầu. Đối với phân bón dạng lỏng, tiến hành đong thể tích trực tiếp.
• Pha loãng mẫu: Thực hiện pha loãng mẫu theo dãy thập phân liên tiếp (10 mũ -1, 10 mũ -2, 10 mũ -3,...) bằng dung dịch pha loãng chuyên dụng để thu được nồng độ vi khuẩn thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc.
• Cấy mẫu và ủ ấm: Sử dụng phương pháp cấy trải hoặc cấy đổ đĩa để đưa một lượng dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa thạch dinh dưỡng. Tiến hành lật ngược các đĩa cấy và đưa vào tủ ấm ở nhiệt độ từ 30 độ C đến 35 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ.
• Đếm khuẩn lạc và nhận diện: Sau thời gian ủ, chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tối ưu (thường từ 30 đến 300 khuẩn lạc). Nhận diện khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus thuringiensis dựa trên các đặc điểm hình thái như khuẩn lạc dạng tròn, rìa không đều hoặc dạng răng cưa, bề mặt mờ đục, màu trắng đục hoặc xám nhạt.

Tính toán và biểu thị kết quả

Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong mẫu thử được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn, thể tích dịch cấy và hệ số pha loãng tương ứng. Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một gam (CFU/g) đối với phân bón dạng rắn hoặc trên một mililít (CFU/ml) đối với phân bón dạng lỏng. Kết quả được làm tròn và viết dưới dạng số mũ cơ số 10 theo quy định kỹ thuật.

Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải bao gồm đầy đủ các thông tin cần thiết như: thông tin nhận biết về mẫu thử, phương pháp lấy mẫu, viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 14114:2024, kết quả thử nghiệm thu được, các chi tiết bất thường ghi nhận trong quá trình phân tích và mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn nhưng có thể ảnh hưởng đến kết quả.